2.2 Daño del ADN
2.2 Daño del ADN
Puede determinarse por distintas técnicas como son la formación de micronúcleos inducida por la radiación, el comet assay o medida del daño inicial de ADN radioinducido estimado mediante roturas dobles de cadena por electroforesis en campo pulsado.
El ensayo de formación de micronúcleos mide el nivel de ADN o daño cromosómico producidos en cultivos in vitro. Los micronúcleos se forman de fragmentos de cromosomas acéntricos o de cromosomas que se han perdido durante o después de la mitosis, identificándose como cuerpos extranucleares pequeños en células en interfase expuestas a la radiación ionizante.
El comet assay es una técnica mediante la cual las células son suspendidas en geles de agarosa y marcadas con un marcador fluorescente, observándose la migración del ADN mediante microscopio fotométrico. El ADN migra hacia el ánodo y esta migración es más pronunciada en células irradiadas que en controles. Las diferencias de los patrones de migración se miden cuantitativamente. La ventaja del comet assay es que nos permite utilizar un bajo número de células, pero no deja de ser una técnica que lleva un tiempo de ejecución largo y laborioso.
La medida del daño inicial radioinducido estimado por el número de rupturas dobles de cadena (dsb) en electroforesis de campo pulsado (PFGE) permite obtener resultados en 7 días aproximadamente. Mediante suspensiones de fibroblastos o queratinocitos se procede a irradiación a diferentes dosis. Posteriormente, se procesan las muestras para realizar una electroforesis de campo pulsado que permite movilizar fragmentos grandes de ADN, como son los producidos tras una rotura doble de la cadena.
Los estudios que relacionan el daño del ADN con la toxicidad no han resultados concluyentes. En el estudio de Nachtrab et al. (1998) en 10 controles, 10 pacientes hipersensibles y 2 con AT (ataxia telangiectasia) se observó que los fibroblastos de individuos hipersensibles y con AT, mostraban una mayor inducción de micronúcleos que los individuos con sensibilidad normal. Sin embargo, en un estudio realizado en 9 líneas de fibroblastos establecidas de biopsias vaginales de pacientes con carcinoma de cérvix pretratamiento y 1 línea de AT, no se observó ninguna relación con la toxicidad y la formación de micronúcleos (O´Driscoll et al., 1998). En el estudio de Oppitz, mediante comet assay, se observó una relación con la toxicidad. Los individuos con AT mostraban un alto daño radioinducido y una baja reparación del daño comparado con individuos con reacciones tisulares normales. Los fibroblastos de pacientes con reacciones agudas y tardías incrementadas tenían una lenta reparación del daño (Oppitz et al., 1999).
En los estudios publicados mediante el análisis por PFGE (Kiltie et al., 1999) se demuestra una posible correlación entre los datos experimentales obtenidos “in vitro” y los datos clínicos sobre toxicidad en pacientes analizados.