4. ANÁLISIS DE APOPTOSIS RADIOINDUCIDA EN LINFOCITOS POR CITOMETRÍA DE
4. ANÁLISIS DE APOPTOSIS RADIOINDUCIDA EN LINFOCITOS POR CITOMETRÍA DE
FLUJO
La radiación ionizante produce la muerte celular en forma de apoptosis, desencadenada por la activación de las caspasas, verdaderos ejecutores del programa de muerte. Aunque el mecanismo preciso de cómo las caspasas son activadas después de la radiación ionizante está todavía siendo investigado, dos modelos de rutas de apoptosis radioinducidas han sido propuestas:
Primeramente, el ADN radioinducido dañado puede iniciar la apoptosis vía mecanismo dependiente de p53, por sobreregulación de la expresión de BAX que regula la apoptosis dependiente de la mitocondria induciendo la formación del apoptosoma, una molécula compleja formada por citocromo c, Apaf-1 y caspasa 9 (Tsujimoto et al., 1998). p53 puede además sobreregular la expresión de FAS, el receptor de muerte de CD95 y activar la cascada de caspasas, tanto a través de mecanismos dependientes como independientes de la mitocondria.
En segundo lugar, los cambios bioquímicos tal como el incremento en la generación de especies reactivas del oxígeno (H2O2) y disminución de glutation, se ha observado en células irradiadas como prioritarias en la pérdida de la integridad de la membrana (Sheng-Tanner et al., 1998). De este modo, el estrés oxidativo puede jugar un rol directo en la apoptosis radioinducida.
De forma parecida, la interacción de la radiación ionizante con la membrana celular induce la hidrólisis rápida de esfingomielina a ceramida (Haimovitz-Friedman et al., 1994) y la activación de la ruta SAPK/JNK (protein kinasa activada por estrés) pro-apoptótica puede ocurrir a partir de las señales de ceramida derivadas de la membrana (Westwick et al., 1995; Verheij et al., 1996). Posteriormente, la fosforilación de c-Jun aumenta la transcripción de los genes reguladores de apoptosis.
Dado que un medio ambiente sometido a estrés también estimula a la SAPK/JNK, la esfingomielina y los sistemas de señalización de SAPK/JNK pueden estar coordinados en la inducción de apoptosis. Además, la formación de ceramida y posterior activación de caspasas, también puede tomar parte en la apoptosis inducida por daño en el ADN (Tepper et al., 1999).
Las células que mueren por apoptosis sufren una serie de cambios morfológicos y bioquímicos característicos como son: la fragmentación del ADN, cambios en la simetría de la membrana, activación de caspasas, alteración en los niveles de las proteínas relacionadas con la muerte celular. Los resultados iniciales de la señalización apoptótica son intracelulares, mientras que la membrana plasmática permanece intacta.
La rotura del ADN genómico entre unidades nucleosomales es un evento irreversible que lleva a la muerte celular. La cuantificación de los fragmentos de ADN mono y oligo-nucleosomales resultantes, pueden ser observados por la técnica ELISA. El número de fragmentos de ADN asociados a histonas, refleja la cantidad de muerte en una muestra particular. Además, este ADN fragmentado, puede ser medido “in situ” mediante ensayo TUNEL usando la enzima deoxynucleotidyl transferasa terminal (TdT). Los ADN fragment End-labeling, son detectados por un marcador fluorescente o por un sustrato colorimétrico.
Por otra parte, los cambios en la morfología celular, incluyendo pérdida de volumen celular, condensación cromatínica y citoplasmática, fragmentación en cuerpos apoptóticos, nos sirven también para la detección de la muerte por apoptosis.
La citometría de flujo puede ser utilizada para cuantificar fragmentos marcados con fluorescencia (DAPI, IP) donde los cambios producidos en la luz Scatter, pueden utilizarse para medir parámetros como son el tamaño y la complejidad celular. Esta técnica ha sido utilizada tanto en investigación como en la práctica clínica rutinaria, por su capacidad de análisis de las características ópticas de partículas individuales presentes en una suspensión celular en cuestión de segundos. Cuando la célula es intersectada por un láser, la dispersión frontal y lateral de la luz o FSC, nos da información del tamaño relativo, mientras que la dispersión lateral o SSC nos da información de la complejidad estructural. Además, los fragmentos de ADN pueden ser aislados de poblaciones apoptóticas y ser analizados por electroforesis en gel de agarosa, observándose la presencia de un patrón en escalera de ADN de aproximadamente 180pb que confirma la presencia de dicho proceso.
Otro proceso bioquímico relevante en la muerte por apoptosis es la translocación de la fosfatidíl serina desde la cara interna del citoplasma a la cara externa de la superficie celular. La detección “in vitro” de la fosfatidíl-serina puede realizarse mediante Annexina V (proteína dependiente de calcio que se une con gran afinidad a la fosfatidilserina). Uniendo a la Annexina V un marcador fluorescente (Ej:FITC) podemos detectar la apoptosis por citometría de flujo o por microscopía de fluorescencia.
La integridad de la membrana puede ser también evaluada con yoduro de propidio (IP) que se intercala en la doble cadena de ADN, permitiendo la diferenciación entre apoptosis temprana y apoptosis tardía.